海洋细菌Zunongwangia sp.两种α-淀粉酶基因的克隆、表达与酶学性质分析

【摘要】淀粉是一种重要的工业原料。α-淀粉酶（内切-1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶,EC3.2.1.1）能够以淀粉为底物,随机水解淀粉分子内部的α-1,4-糖苷键,广泛应用在淀粉加工、食品、造纸、纺织和医药等多个领域,具有重要的经济价值。本研究从海洋细菌Zunongwangiasp.中扩增得到两个新的淀粉酶基因,其中一个为典型的α-淀粉酶,另一个为具有环糊精水解活性的α-淀粉酶；将它们克隆到表达载体pGEX-6P-1上,并在EscherichiacoliBL21（DE3）中实现了异源表达；纯化了重组的两个α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究。获得如下研究成果：具有环糊精水解活性的α-淀粉酶AmyZ1:AmyZ1的基因（amyZ1）全长1848bp,GC含量37.55%,编码一个615个氨基酸的多肽,预测等电点pI为4.65、蛋白分子量71.15kDa。SignalP4.1Server预测该多肽N-端有一个由21个氨基酸组成的信号肽序列。成熟的α-淀粉酶由594个氨基酸组成,预测等电点pI和分子量分别为4.60和68.86kDa。序列比对显示,AmyZ1属于糖苷水解酶家族13,与Gillisiasp.CBA3202假设的α-淀粉酶（WP010227850）有最高的序列一致性（72%）；且AmyZ1除具有典型α-淀粉酶的保守序列外,在其N-端和C-端还分别存在着环麦芽糊精酶的保守结构域,与Bacteroidessp.CAG:714的环麦芽糊精酶（WP022339125）有45%的序列一致性。AmyZ1在35℃和pH7.0时活性最高,在0℃时仍有39%的活性,显示出其冷适应性。AmyZ1表现出极端的耐盐性,在1.5MNaCl时有最大活性（126%相对活性）,在4MNaCl时保留有93%的活性。以可溶性淀粉为底物时,AmyZ1的Km和kcat值分别为2.74mgml-1和316.49s-1；而当反应混合液中存在1.5MNaCl时,这两个值分别为2.30mgml-1和329.58s-1,相应地kcat/Km值从115.51mlmg-1s-1增加到143.30mlmg-1s-1。NaCl和CaCl2可显著提高酶的热稳定性：AmyZ1与1.5M的NaCl在35℃下保温120min后,其残余酶活相对于没有NaCl时提高了13.2倍；而1mMCaCl2的存在使其相应酶活提高了11.4倍。底物特异性实验显不,AmyZ1除对可溶性淀粉有最高活性外,也可以降解环糊精,是一个具有环糊精水解活性的α-淀粉酶。α-淀粉酶AmyZ2:AmyZ2的基因（amyZ2）全长1446bp,GC含量38.31%,编码一个481个氨基酸的多肽,预测等电点pI为4.24、蛋白分子量为55.17kDa。SignalP4.1Server预测该多肽N-端有一个由24个氨基酸组成的信号肽序列。成熟的α-淀粉酶由457个氨基酸组成,预测等电点pI和分子量分别为4.14和52.31kDa。序列比对显示,AmyZ1属于糖苷水解酶家族13,与已报道的PyrocoocusWoesei的α-淀粉酶（PDBID1MWO）具有最高的序列一致性（45%）。AmyZ2在50℃和pH7.0时活性最高,且在pH10.0和11.0的缓冲液中放置5d后（25℃）,仍分别有143%和126%的相对活性,显示出其较好的碱稳定性。AmyZ2表现出极端的耐盐性,在2MNaCl时有最大活性（138%相对活性）,在3.5MNaCl时保留有100%的活性；AmyZ2在0-4MNaCl中相对稳定。NaCl的存在可显著提高酶的热稳定性：AmyZ2与2M的NaCl在50℃下保温3h后,其残余酶活相对于没有NaCl时提高了53.6倍。在以可溶性淀粉为底物时,AmyZ2的Km和kcat值分别为11.71mgml-1和1449.43S-1,kcat/Km值为123.78mlmg-1s-1。AmyZ2对可溶性淀粉的比活力为1662.4U/mg。
【作者】秦永军；
【导师】刘子铎；
【作者基本信息】华中农业大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】α-淀粉酶；Zunongwangiasp.；冷活性；耐盐性；碱稳定性；热稳定性；

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